مقدمه
در دنیای امروز آنالیزهای شیمیایی و زیستی، دقت، سرعت و تکرارپذیری نتایج اهمیت بسیار بالایی دارند. یکی از پرکاربردترین و دقیقترین روشهای آنالیز کمی و کیفی مواد، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا High Performance Liquid Chromatography یا HPLC است. این روش بهطور گسترده در آزمایشگاههای کنترل کیفیت، صنایع داروسازی، صنایع غذایی، پتروشیمی، محیط زیست و آزمایشگاههای تشخیص طبی مورد استفاده قرار میگیرد.
در این مقاله، بهصورت جامع به روش HPLC، اصول عملکرد، اجزای دستگاه، انواع روشها، کاربردها، مزایا و محدودیتهای آن میپردازیم .
HPLC چیست؟
HPLC یک تکنیک جداسازی و آنالیز است که بر پایه عبور فاز متحرک مایع با فشار بالا از ستون حاوی فاز ساکن عمل میکند. اجزای موجود در نمونه، بر اساس میزان برهمکنش با فاز ساکن، با سرعتهای متفاوت از ستون خارج شده و شناسایی میشوند.
برخلاف کروماتوگرافی مایع معمولی، در HPLC از فشار بالا (تا چند صد بار) استفاده میشود که باعث افزایش دقت جداسازی و کاهش زمان آنالیز میگردد.
اصول عملکرد روش HPLC:
اساسا HPLC بر پایه توزیع متفاوت اجزای نمونه بین فاز ساکن و فاز متحرک است. زمانی که نمونه وارد سیستم میشود:
1. فاز متحرک نمونه را از ستون عبور میدهد
2. هر ترکیب بسته به قطبیت، اندازه و ساختار شیمیایی با فاز ساکن برهمکنش متفاوتی دارد
3. این تفاوت باعث جداسازی ترکیبات در زمانهای مختلف (Retention Time) میشود
4. آشکارساز(دتکتور) سیگنال هر ترکیب را ثبت کرده و کروماتوگرام ایجاد میشود.
اجزای اصلی دستگاه HPLC:
1. مخزن فاز متحرک
حاوی حلال یا مخلوطی از حلالها مانند: آب، متانول، استونیتریل یا بافرهاست. کیفیت حلال نقش مهمی در دقت آنالیز دارد.
2. پمپ (Pump)
پمپ وظیفه ایجاد فشار بالا و جریان یکنواخت فاز متحرک را بر عهده دارد. پمپها میتوانند:
• ایزوکراتیک
• گرادیانی و … باشند.
3. سیستم تزریق نمونه (Injection)
نمونه با حجم دقیق (معمولاً چند میکرولیتر) به سیستم وارد میشود. این کار به صورت دستی یا اتوماتیک انجام میگیرد.
4. ستون (Column)
مهمترین بخش سیستم HPLC است. ستون حاوی فاز ساکن بوده و جداسازی واقعی در آن اتفاق میافتد. ستونها بر اساس:
• طول
• قطر
• اندازه ذرات طبقهبندی میشوند.
5. آشکارساز (Detector)
آشکارساز ترکیبات خروجی از ستون را شناسایی میکند. متداولترین آشکارسازها:
- UV-Vis
- PDA
- فلورسانس
- RI
6. سیستم ثبت داده
اطلاعات آشکارساز بهصورت کروماتوگرام ثبت و تحلیل میشود.
انواع روشهای HPLC
1. HPLC فاز معکوس (Reverse Phase HPLC)
رایجترین نوع HPLC که در آن:
• فاز ساکن غیرقطبی C18) ، (C8
• فاز متحرک قطبی است. این روش برای اغلب ترکیبات دارویی کاربرد دارد.
2. HPLC فاز نرمال (Normal Phase HPLC)
در این روش:
• فاز ساکن قطبی
• فاز متحرک غیرقطبی است و برای ترکیبات خاص استفاده میشود.
3. HPLC تبادل یونی (Ion Exchange)
بر اساس بار الکتریکی مولکولها عمل میکند و در آنالیز پروتئینها و یونها کاربرد دارد.
4. HPLC غربال مولکولی (Size Exclusion)
جداسازی براساس اندازه مولکولی انجام میشود و در بیوشیمی بسیار مهم است.
کاربردهای روش HPLC :
- صنایع داروسازی
• کنترل کیفیت داروها
• تعیین خلوص ماده مؤثره
• شناسایی ناخالصیها
• تست پایداری دارو
- آزمایشگاههای تشخیص طبی
• اندازه گیری داروها در سرم
• آنالیز ویتامینها و هورمونها
• تشخیص مواد سمی
- صنایع غذایی
• اندازهگیری افزودنیها
• تشخیص سموم و آفتکشها
• کنترل کیفیت محصولات غذایی
- صنایع محیط زیست
• آنالیز آلایندههای آب و خاک
• بررسی فلزات و ترکیبات آلی خطرناک
مزایای روش HPLC :
✔ دقت و صحت بالا
✔ حساسیت بسیار زیاد
✔ تکرارپذیری بالا
✔ قابلیت آنالیز ترکیبات پیچیده
✔ سرعت بالا در جداسازی
✔ سازگاری با انواع آشکارسازها
محدودیتها و معایب HPLC :
❌ هزینه بالای دستگاه و ستونها
❌ نیاز به اپراتور آموزشدیده
❌ حساسیت به کیفیت حلال و نمونه
تفاوت HPLC با GC :
– در روش HPLC فاز متحرک مایع است و در روش GC فاز متحرک به فرم گاز است.
– در HPLC دمای انجام تست دمای محیط بوده اما در متد GC از دمای بالا استفاده می شود.
HPLC- برای شناسایی و جداسازی ترکیبات غیر فرار مناسب است و GC برای ترکیبات فرار.
-کاربرد زیستی روش HPLC بالا ولی GC محدودتر می باشد.
نکات مهم در بهینهسازی روش HPLC :
• انتخاب ستون مناسب
• تنظیم pH فاز متحرک
• انتخاب طول موج صحیح
• استفاده از فیلتر مناسب
• نگهداری صحیح از ستون
نتیجهگیری
روش HPLC یکی از قدرتمندترین و دقیقترین تکنیکهای آنالیز در علوم آزمایشگاهی است که نقش کلیدی در تشخیص ، کنترل کیفیت و تحقیقات دارد. با انتخاب صحیح پارامترهای دستگاه و رعایت اصول کار، میتوان نتایج بسیار قابل اعتمادی به دست آورد. به همین دلیل، HPLC همچنان یکی از ستونهای اصلی آنالیز شیمیایی مدرن محسوب میشود.
